Wykrywanie patologicznego białka prionowego w nabłonku węchowym w sporadycznej chorobie Creutzfeldta-Jakoba cd

Błona śluzowa układu oddechowego, uzyskana z przylegających regionów małżowin, była przetwarzana w ten sam sposób. Lewą węchową bańkę węchową i przewód, wraz z ipsilateralną korą prepiriform (włączając boczny zakręt węchowy i węchowy węchowy region) i koziołkowicą i korą śródwęchową, utrwalono do badania neuropatologicznego. Obszary przeciwległe zamrożono i przechowywano w temperaturze -80 ° C, aż do wykonania analiz biochemicznych. Ponadto, nerw wzrokowy, korę czołową, skroniową, ciemieniową i potyliczną, hipokamp, wzgórze, prążkowie i móżdżek uzyskano zarówno w badaniach patologicznych, jak i biochemicznych. Próbki pobrane do badania patologicznego wstępnie traktowano kwasem mrówkowym przez godzinę, a następnie osadzono w parafinie. Próbki biopsji zatopionej w parafinie ośmioro pacjentów z prawdopodobną chorobą Alzheimera, 19 trzech pacjentów z prawdopodobną chorobą Parkinsona (zdiagnozowanych według ustalonych kryteriów), 20 pacjentów z postępującym porażeniem nadjądrowym i jednego pacjenta z neuropatologicznie potwierdzoną chorobą Lewy ego poddano również analizie immunohistochemicznej dla PrP. Okazy te otrzymano w latach 1990-1992.
Analiza immunocytochemiczna
Dziesięć odcinków parafiny o grubości 8 .m uzyskano z każdej próbki błony węchowej i innych tkanek. Skrawki odparowano, ponownie uwodniono, potraktowano 98% kwasem mrówkowym przez 20 minut w temperaturze pokojowej i autoklawowano w 121 ° C przez 10 minut w 1,5 mM kwasie chlorowodorowym. Skrawki płukano, a następnie inkubowano przez noc w 4 ° C z monoklonalnym przeciwciałem 3F4 (rozcieńczenie 1: 500), które rozpoznaje inne niż ludzkie prionowe białko prionowe i ludzkie reszty białkowe prionu 109 do 112,21 Mysiego monoklonalnego przeciwciała LB509 (rozcieńczenie 1: 500, Zymed Laboratories) , który rozpoznaje .-synukleinę, wyrażaną przez neurony receptora węchowego i komórki podstawne błony węchowej, 22 zastosowano do jednoznacznej identyfikacji tych komórek, gdy jest to konieczne. Późniejsze wykrywanie przeciwciał wymagało inkubacji z biotynylowanym drugorzędowym przeciwciałem przeciw kozie przez jedną godzinę (rozcieńczenie 1: 500, Vector Laboratories) w temperaturze pokojowej, a następnie inkubację z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza (zestaw Vectastain ABC-Elite, Vector Laboratories) zgodnie z zgodnie z instrukcjami producenta. Próbki następnie zabarwiono 0,06% 3,3 -diaminobenzydyny jako chromogenu i 0,006% nadtlenku wodoru w 50 mM buforze TRIS, pH 7,6.
Analiza Immunoblot
Z każdej próbki tkanki centralnego układu nerwowego homogenizowano 100 mg tkanki w 0,9 ml buforu do lizy (100 mM chlorek sodu, 10 mM EDTA, 0,5 procent eteru nonaetylenoglikol oktylofenylowego, 0,5 procent dezoksycholanu sodu i 10 mM TRIS, pH 7,4) . W przypadku błony węchowej lub oddechowej, każdą próbkę zawierającą 100 mg tkanki homogenizowano w 0,4 ml buforu do lizy. Porcje dostosowano do końcowego stężenia 20 lub 100 .g proteinazy K (Boehringer Mannheim) na mililitr i inkubowano w 37 ° C przez 10 do 60 minut. Próbki, odpowiadające 300 .g wilgotnej tkanki, rozdzielono na 12% żelu na elektroforezę z dodecylosiarczanem sodu-poliakrylamidem i przeniesiono na membranę z difluorku poliwinylidenu (Immobilon P, Millipore) na dwie godziny przy 60 V
[podobne: psychoterapia zabrze, dzienniczek pomiaru ciśnienia tętniczego, psychoterapia bielsko ]
[patrz też: gumtree wieliczka, dzienniczek pomiaru ciśnienia tętniczego, wyszukiwarka skierowań nfz ]