Paraneoplastyczny pęcherzyca – autoimmunologiczna choroba śluzówkowo-skórna związana z neoplazją cd

Skrawki zamrożono, a następnie inkubowano z rozcieńczeniami surowicy od pięciu pacjentów i osobników kontrolnych, po czym dodano znakowane fluoresceiną anty-ludzkie IgG (Cappel Worthington, West Chester, PA). W testach na poliklonalność autoprzeciwciał pacjentów wykorzystano zamrożone skrawki skóry myszy. Rozcieńczenia surowicy pacjentów zastosowano jako źródło pierwotnego przeciwciała. Mysie przeciwciała monoklonalne o ustalonej swoistości dla ludzkich podklas IgG od do 413, jak również przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej immunoglobulinie kappa i łańcuchom lekkim lambda (Cappel) zastosowano jako przeciwciało drugorzędowe, a następnie dodano wyznakowane fluoresceiną przeciwciało antymurynowe (Cappel). Preparaty badano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (Olympus, Tokio).
Immunoprecypitacja
Immunoprecypitację przeprowadzono zgodnie z techniką Stanley i in. 14. Ludzkie keratynocyty inkubowano z aminokwasami znakowanymi l4C (NEN Research, Boston) w pożywce do hodowli keratynocytów (KGM, Clonetics, San Diego, Calif). Pierwotne hodowle mysich keratynocytów zostały ustalone15 i inkubowane z metioniną znakowaną 35S (Translabel, ICN Pharmaceuticals, Irvine, CA) w minimalnej pożywce podstawowej z niedoborem metioniny Dulbecco z 13 procentową surowicą płodową (Gibco, Grand Island, NY). Hodowle ekstrahowano w niejonowym detergencie (0,5% NP-40, Calbiochem, La Jolla, CA) w soli fizjologicznej buforowanej TRIS w temperaturze 4 ° C w obecności 2 mM fenylometylosulfonylofluronu (Sigma, St. Louis) i wirowano przy 100 000 x g przez jedną godzinę; supernatant dializowano wobec 0,3% NP-40 w soli fizjologicznej buforowanej TRIS. Wyznakowane ekstrakty sekwencyjnie inkubowano z surowicą od pacjentów lub kontrolnych i gronkowców przenoszących białko A (Pansorbin, Calbiochem). Poszczególne immunoprecypitaty analizowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem-poliakrylamidem, w którym zastosowano 5-procentowy żel stropowy, a oddzielone białka wizualizowano za pomocą autoradiografii.
Zastosowano identyczne techniki do przeprowadzenia immunoprecypitacji z mysim monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla desmoplakiny I (klon DP i 2-2.15, Boehringer-Mannheim, Indianapolis), z tym wyjątkiem, że zastosowano G-agarozę z białka Staphylococcus (ImmuBind, Genex, Gaithersburg, Md.) W miejsce Pansorbin.
Przygotowanie immunoglobuliny
Siarczan amonu (Sigma) dodano do surowicy od pacjenta opisanego w raporcie przypadku, do końcowego stężenia 24,3 g na decylitr. Uzyskany osad ponownie zawieszono i dializowano wobec soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,2), a następnie zatężono przez ultrafiltrację ciśnieniową w mieszanym naczyniu (Amicon, Bedford, MA) do końcowego stężenia białka wynoszącego 100 mg na mililitr. Końcowy roztwór wzbogacony w immunoglobulinę sterylizowano przez filtrowanie (Millex [wielkość porów, 0,25 .m], Millipore, Bedford, MA) przed wstrzyknięciem myszom. Kontrolne frakcje immunoglobulin przygotowywano z połączonej normalnej ludzkiej surowicy w ten sam sposób.
Pasywne przeniesienie immunoglobuliny
Patogenność ludzkich autoprzeciwciał od pacjenta w przypadku indeksu została przetestowana przez pozajelitowe pasywne przeniesienie przeciwciał na myszy neonatalne.17 W skrócie, osiem myszy BALB / c uzyskano w wieku 24 do 48 godzin (masa ciała, 1,5 do 2,0 g)
[więcej w: karnidin, olx czaplinek, sanatorium uzdrowiskowe solinka ]