Cząsteczki sygnałowe w nadciśnieniu płucnym w niewydolnym stanie płodowym cd

Badanie zostało zatwierdzone przez instytucyjną komisję odwoławczą Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego. W przypadku pacjentów z zakrzepowo-zatorowym nadciśnieniem płucnym tkanek uzyskano z płata, który był najbardziej dotknięty chorobą okluzyjną w angiografii przedoperacyjnej. Pacjenci z nieprawidłowościami zastawki mitralnej byli poddani biopsji pośrodkowej, pacjenci po przeszczepieniu serca i płuca byli poddani biopsji górnych i dolnych płatów obu płuc, a pacjenci, którzy otrzymali przeszczep jednego płuca i pacjenci z grupy kontrolnej przeszli biopsję górnego i dolnego płata po stronie dotkniętej. Próbki pobierano przed wprowadzeniem krążenia pozaustrojowego lub przed wykonaniem resekcji płuc, podczas wentylacji przy ułamku zainspirowanego tlenu w 100%.
Sekwencja BMPR2 i ALK1 u pacjentów z pierwotnym nadciśnieniem płucnym
Komplementarny DNA (cDNA) BMPR2 i ALK1 zamplifikowano z ludzkiego RNA płuca przez odwrotną transkryptazę-reakcję łańcuchową polimerazy (RT-PCR), subklonowano i sekwencjonowano przy użyciu analizatora genetycznego ABI-PRISM 3100 (Applied Biosystems). Dane dotyczące sekwencji porównano z danymi w bazie danych Narodowego Centrum Informacji o Biotechnologii Entrez Nucleotide (numery dostępu, NM_001204 dla BMPR2 i Z22533 dla ALK1).
Oczyszczanie Angiopoetyny-1 i Leczenie Komórek śródbłonka
Znacznik epitopu, C-terminalną polihistydynę dodano do mysiego cDNA angiopoetyny-1, cDNA subklonowano do plazmidu i wytworzono rekombinowane białko angiopoetyny-1 w bakteriach BL21. Białko oczyszczono przy użyciu kolumny powinowactwa (Ni-NTA, Stratagene). Rozmiar i czystość rekombinowanej angiopoetyny-1 zweryfikowano przez barwienie błękitem Coomassie i immunoblotting, a aktywność biologiczną białka potwierdzono przez indukcję fosforylacji receptora TIE2 in vitro 13.
Pierwotne komórki śródbłonka płucnego izolowano z tętniczek o średnicy 500 do 1500 .m od tkanki płucnej osób z prawidłowym ciśnieniem i hodowano do 60-procentowego zlewania. Subkultury tych komórek inkubowano przez dwie godziny w pożywce bez surowicy i traktowano rekombinowanym białkiem angiopoetyny-1 (50 ng na mililitr). Porcje komórek zostały seryjnie usunięte w celu oznaczenia ilościowego fosforylacji TIE2 i ekspresji BMPR1A.
Immunoprecypitacja i Western Blotting
Przeprowadzono blotting typu Western, jak opisano wcześniej12 z kozim poliklonalnym anty-TIE2, mysim monoklonalnym anty-BMPR2 (R & D Systems) i kozim poliklonalnym anty-angiopoetyną-1, anty-angiopoetyną-2, anty-BMPR1A i anty-aktyną (Santa Cruz Biotechnologia). Fosforylację TIE2 oceniano za pomocą początkowych inkubujących ekstraktów białkowych z wstępnym wiązaniem przeciwciała anty-TIE2 do kulek agarozowych powlekanych białkiem G (Roche). Immunoprecypitowane białka rozdzielono następnie przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu i przeniesiono na nitrocelulozę. Ilościową immunoblotting fosforylacji TIE2 przeprowadzono z użyciem przeciwciała przeciw fosfotyrozynie (Cell Signaling Technology). Bloty przemyto i ponownie sondowano kozim anty-TIE2, aby zweryfikować równe poziomy TIE2.
RT-PCR i Northern Blotting
RT-PCR przeprowadzono jak opisano wcześniej, 14 przy użyciu następujących starterów: angiopoetyna-1, 5 GGCAACTGTCGTGAGAGTACGA3 i 5 CATTTAGATTGGAGGGGCCACA3 ; BMPR1A, 5 GGTAAAGGCCGATATGGAGAAG3 i 5 TAGGCCGAAGCTGTAGATGTCA3 ; BMPR2, 5 ATGAGCCTTTACTGAGACGAGAG3 i 5 CGCCACCGCTTAAGAGAATAG3 ; i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa, 5 CCTGCTTCACCACCTTCTTG3 i 5 CATCATCTCTGCCCCCTCTG3
[hasła pokrewne: olej śliwkowy, masaż limfatyczny cena, usg wroclaw ]
[hasła pokrewne: stomatologia rzeszów, laserowa depilacja twarzy, chirurgia twarzowo szczękowa ]